Análisis de proteínas
Extracción de proteína total
En el análisis de proteínas, una de las partes mas importantes es la extracción, ya que durante la lisis celular se liberan enzimas que pueden degradar las proteínas de interés o éstas pueden perder sus características nativas y darnos falsos resultados; particularmente cuando la proteína de interés tiene modificaciones químicas como fosforilaciones, acetilaciones, metilaciones o ubiquitinaciones.
Nosotros sabemos cómo extraer las proteínas a partir de muestras como tejido congelado, tejido fresco, células en cultivo, etc. Conservando sus estructuras nativas y sus funciones.
No arriesgues esa muestra valiosa, nosotros hacemos la extracción y
cuantificación de proteínas.
Cuantificación por el método de Bradford.
La cuantificación de proteínas es esencial para realizar experimentos confiables. El método de Bradford, utiliza un colorante llamado azul brillante de Coomasie o G-250 que puede ser leído a 595 nm. El valor obtenido es
comparado con una curva estándar. Su rango de sensibilidad es de 1 – 15g lo que lo hace un método muy sensible y rápido.
SDS-PAGE
La electroforesis con gel desnaturalizante de poliacrilamida es un método muy comúnmente utilizado para el análisis de proteínas, en dónde éstas se separan exclusivamente por su masa molecular (5-250 KDa). El dodecil sulfato de sodio (SDS) actúa como surfactante cubriendo las proteínas, por lo que le confiere una carga similar. Al pasar por un campo eléctrico, las proteínas migrarán hacia el ánodo (polo negativo); su velocidad de
migración dependerá solo de su masa.
Al final, las proteínas estarán distribuidas a lo largo del gel, las más ligeras estarán abajo y las más grandes arriba. Para poder visualizar las proteínas, se utiliza una tinción con Coomassie al 10%.
Además, si lo que necesitas es transferir las proteínas a una membrana para su posterior identificación con anticuerpos, entonces se usará un sistema de transferencia seca a una membrana de PVDF (Polyvinylidene difluoride).
Determinación de masa molecular de una proteína desconocida
Una vez que se realizó la SDS-PAGE y se realizó la tinción con Coomassie, puede realizarse la estimación de la masa molecular de una proteína X, utilizando como referencia un marcador de peso molecular